01

OD600的应用--帮助了解细菌的生长状态

OD600是指在600nm波长处的吸光值，常常被用于分析细菌生长和进行抗生素敏感性测试，在细菌检测中，测量波长需要选择在生物材料吸光度最小的范围内。因此，这些细菌生长曲线测量通常使用600-670nm左右的红色波长。在细菌连续培养过程中，在不同的时间点检测菌液的OD600值，然后以时间为横坐标，OD600为纵坐标，描绘细菌的生长曲线。结合生长曲线，可以评估细菌所处的生长阶段，进而可以确定合适的诱导表达或收获的时间点。

02

OD600 测量菌液/细胞浓度的原理

细菌密度的测量方式是通过光的散射，也就是看浑浊程度而不是吸光度，光的散射程度反应的是细胞的生物质量而不是细胞个数，也称浊度测量。浊度法测量非均质溶液中是否存在固体颗粒。固体颗粒可以是细胞、沉淀、聚集体或溶液中存在的任何其他固体物质。颗粒会散射光束中的光子，因此仪器检测器会检测到较低的光强度。这种现象与吸光度测量截然不同，吸光度测量是指光子被均匀溶液中的特定染料吸收，吸光度和浊度散射的基本区别如图 1 所示。

图1：吸光度和浊度散射的基本区别, 在吸光度测定中，由于光被样品吸收，光电探测器中的光强会减弱（A）；在浊度测定中，入射光由样本中的细胞/粒子随机产生散射。这将导致方向的不确定性。继续沿直线传播的光会进入检测器，光强也会减弱（B）

03

使用不同的设备测量OD600细菌浓度可能得到不同的数值

对于具有浊度的样品，如细菌溶液、细胞培养物，测量的“吸光值”是由于光散射，而不是溶质分子光吸收的结果。由于光散射的程度受系统光学特性(比色池和仪器出口狭缝之间的距离、单色器光学特性、狭缝几何特性等)的影响，使用不同类型的分光光度计测量同一样品时，可能会得到不同的OD600读数。

那我们来看下主要有哪些原因影响浊度的测量呢？

一是浊度测量受样品中颗粒浓度的影响

浊度测量总是在异质样品中进行，一般需要测量96/ 384 孔板，现在多数酶标仪通常使用相当窄的测量光束。通常情况下，微孔板光度计的光束直径不到一毫米，当光束穿过96孔板的孔时，测量光束只能覆盖样品体积的很小一部分（图2）。另外，现代微孔板光度计的采样时间也很短，通常为毫秒级，这些对于浊度测量来说并不是最佳选择会增加变化。比如液体中的固体颗粒并非处于静止状态，而是在整个液体中自由漂浮。因此，当样品中只有少量固体颗粒时，在重复测量中，相同数量的颗粒出现在光束内的概率很低。如果样品中有100 个颗粒，那么测量光束区域内的颗粒数最有可能是1个，但随机情况下可能是0个或2个，甚至3个。当采样时间也以毫秒为单位时，液体中颗粒的动态流动不会明显改变单个测量中的这种情况。因此,当OD值较低时，检测精度可能会明显降低，吸光度检测的 CVs% 也会大于正常值。

同样，当样品中的颗粒数量增加到非常多时，从颗粒上散射的光子会撞击到另一个颗粒并重新散射。这将导致一些散射光子经过多次散射后到达检测器。因此，浊度测量的线性测量范围总是低于吸光度测量。

二是不同仪器分光光度计的设计影响浊度测量

吸光度和浊度测量之间第二个非常重要的区别是，不同仪器的光学设计会影响所得到的OD值（图 3）。因此，不同厂家生产的微孔板光度计没法对同一样品给出相同的OD值。这里有两个影响因素：一是光电探测器收集窗口的大小，二是收集狭缝的大小。探测器窗口越大，收集到的轻微散射光子就越多，因此观测到的OD 值就越低。还有一个主要问题是样品到检测器的距离。如果检测器距离样品很远，即使是轻微散射光子也会到达检测器；如果很近，即使是强烈散射光子也会被检测器收集到。因此，这个距离对得出的OD 值影响也很大。由于每个制造商的光学设计不同，这两个参数（距离和探测器的大小）在两台不同的仪器中永远不会相同。这些因素不会影响吸收测定，因为在吸收测定中光束形状保持不变。检测器的大小或距离不会改变到达检测器的光量。

图示3：检测器收集窗口的大小和与样品的距离都会改变所测得的OD值，因此不同的仪器会对相同的样品给出不同的OD值。检测到的OD值差异很容易达到20-40%。

比如下图中，在浊度测定结果的偏差表明，Multiskan Sky 和 SkyHigh 采用了非常相似的光学设计，因此结果几乎相同，但Varioskan LUX 和 Multiskan FC 采用了不同类型的光学器件，因此与Sky和SkyHigh有很大不同，两者之间也存在明显差异。但在吸光度测量方面，所有四款酶标仪的测量结果完全相同。

图示4：不同型号酶标仪检测吸光度和浊度的比较

因此，对于OD600测量，不同酶标仪的结果不能直接进行比较。对于OD600测量，使用相同型号的分光光度计可以保障良好的重复结果。而对于不同酶标仪的结果首先需要使用适当的校准曲线进行标准化。

常规的酶标仪检测都具备了光吸收检测功能，赛默飞多款酶标仪具有单独模块用于浊度检测，比如单功能酶标仪FC，配有比色杯模块的Multiskan SkyHigh 以及多功能酶标仪Varioskan LUX等，都是核酸、蛋白质、菌液浓度及其他物质测量的多功能仪器，可为用户提供完善的解决方案。